2014年1月第1期的《柳叶刀》杂志是例行的年度回顾总结专辑，其中对于2013年儿科神经专业的年度总结题目是“儿科神经病学：一个DNA技术年(paediatric neurology：a year of DNA technology)”。文章开篇第一句话就是“在2013年，DNA技术的快速发展提高已经根本改变了儿科神经病学”。由于病种纷繁复杂，尤其是存在大量的神经遗传性疾病，儿科神经病学历来给人的印象是治疗困难而诊断更困难。然而，近年来随着多种先进的分子遗传学检测手段，主要是二代测序技术以及微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)技术的日渐成熟，检测价格迅速下降，从而大量应用于临床诊断及科学研究，儿科神经遗传病的诊治水平取得了突飞猛进的发展。不仅由于一批新的致病和(或)易感基因的发现使得我们认识了更多的新疾病，而且对于一些既往明确的遗传病的临床表型也更加了解；不仅促进了诊断，而且也催生了一些针对发病机制的更加有效及个体化的新治疗，使得儿科神经遗传病重诊断轻治疗的传统印象有了很大的改观。然而，这些新技术临床应用的快速发展也带来了很多新的挑战和问题。我国是人口大国，遗传性疾病尤其是神经遗传疾病，由于种类繁多，实际患者人数并不少，因而已经成为我国医疗卫生领域十分关注的重大问题。近年来，我国的遗传病检测技术发展非常迅速，已经基本和世界同步，目前上述遗传检测新技术也已经开始了临床应用。但是，由于处于起步阶段，所以面临的挑战和问题也就更多，涉及如何选择合适的检测技术、如何解读检测结果以及如何看待其临床意义等诸多方面。现就此进行简单的述评以供广大儿科同行进一步讨论。
1.第二代测序技术：第二代测序技术是相对于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而言的。第二代测序技术可以边合成边测序，与第一代测序技术相比，具有速度快、通量高、测序费用相对低的优势。目前主要包括：(1)全基因组测序(whole genome sequencing)：对某种生物的基因组中的所有基因进行测序，能真实反映整个生物体的全部遗传信息。(2)全外显子测序(whole exome sequencing，WES)：利用目标序列捕获技术对基因组的全部外显子实施捕获并进行高通量测序的一种技术，与全基因组测序相比，WES在很好地涵盖了蛋白编码信息的前提下，具有成本更低、测序周期更短、数据分析更方便等优势。但是WES也有其局限性，即WES无法了解到内含子区等非编码序列是否发生改变，从而无法全面了解基因组的情况。(3)疾病靶向序列测序技术(disease target sequencing，DTS)：原理与WES类似，也是先捕获目标序列再进行高通量测序。按需定制是其最大的优点，即与某一类疾病(如癫痫)、临床表型(如共济失调)相关的所有致病基因可以被整合到一个基因测序包中进行高通量测序，特别适合临床遗传性病因异质性强的疾病。与WES相比，DTS优势在于目标区域更加集中，测序成本进一步降低，测序和数据分析的周期进一步缩短，从而更加经济、快捷，更具有针对性，因而更符合临床诊断的要求。目前，DTS是应用最广泛的利用二代测序的临床诊断方法，包括癫痫、智力障碍、先天遗传代谢病、线粒体病、共济失调、遗传性痉挛性截瘫、神经肌肉病等。在某些病因异质性很强，而标本取材及诊断困难的疾病(如遗传性肌病)，DTS由于创伤小、能同时检测导致类似临床表型的所有几十种甚至上百种基因的优点，可以提前到临床诊断之后，神经生化、神经病理等之前进行。DTS也有自身的缺点：(1)不能检测未知的致病基因；(2)新的疾病或者表型相关基因不断被发现，DTS所纳入的基因就应该不断更新，这个涉及测序公司的成本和测序基因完整性的平衡，好的DTS检测包应该定期更新纳入的基因；(3)DTS基因包也有可能因为设计缺陷导致纳入的已知基因不全面(比如检索的不全面等)，而导致关键遗传信息的遗漏。
2.拷贝数检测技术：主要包括微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)和多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)。(1)aCGH是指在芯片上应用携带有不同荧光素的病例样本和正常对照样本进行共杂交，以此发现病例样本基因组相对于正常对照样本基因组的DNA拷贝数变化(copy number variation，CNV)。aCGH技术的优势在于用于单次检测的DNA样本量极少，能够覆盖整个基因组，而且分辨率高(最好的aCGH可以精确到最小2kb的CNV)，检测周期短(7-10 d)，无需细胞培养，而且多种样本类型(如外周血标本、培养的细胞、组织标本等)均可以进行检测，因而显著优于传统细胞遗传学技术。目前在美国，对于智力障碍患儿aCGH已经取代传统的核型分析作为常规一线的细胞遗传学检测方法，其病因学诊断阳性率达到20％以上。目前aCGH技术在国内应用最大的问题还是价格问题。另外技术上，aCGH不能检测<2kb的DNA片段重复或缺失。(2)MLPA是指应用探针与目的DNA序列进行杂交，通过连接、PCR扩增、产物电泳分离及数据收集等步骤对目的DNA序列进行定性和半定量分析的检测技术。MLPA具有经济高效、特异、试验周期短、操作方便等诸多优点，可以明确基因是否重复或缺失。与aCGH相比，其缺点主要是一次检测的区域范围有限，远小于aCGH，不能覆盖整个基因组，其最大的优点是针对已知的DNA小范围的CNV检测，价格远低于aCGH，而且理论上能够精确到20bp，数据分析简单、快捷。例如佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease，PMD)，用MLPA检测PLP1基因的CNV，所需检测价格成本<500元/例(实际商用检测成本还需考虑人工等多因素，所以会更高一些)。
1.了解不同检测方法的优缺点，合理选择检测新技术：(1)临床诊断明确的已知致病基因单一的神经遗传病：可以用一代Sanger测序直接进行致病基因检测，例如典型的Dravet综合征，就可以直接测序SCNIA基因。但是如果致病基因很大，比如Duchenn肌营养不良的DMD基因，采用一代Sanger测序，无论所需时间以及费用均高于采用二代测序技术的疾病靶向测序基因包，此时可能选用后者更加经济、快速。(2)临床只能做出表型诊断、病因异质性强的神经遗传病：例如早发性癫痫脑病、非综合征性癫痫伴智力障碍性疾病、遗传性共济失调等，最适宜采用二代测序技术的疾病靶向测序基因包。(3)临床鉴别诊断困难的神经遗传病：例如儿童交替性偏瘫、发作性运动障碍等发作性疾病与癫痫有时候鉴别困难，应用同时包括遗传性癫痫和儿童交替性偏瘫、发作性运动障碍的特异性靶向测序基因包，就有可能帮助做出诊断。我们已经应用此基因包诊断了1例长年诊断不清(误诊为癫痫)的儿童交替性偏瘫病例。(4)临床怀疑CNV所致疾病：如果致病基因明确，例如佩梅病的PLP1基因、Dravet综合征的SCN1A基因的CNV检测就可以直接用MLPA方法；如果致病基因和(或)CNV位点众多，则可以直接用aCGH，例如智力障碍、孤独症等发育障碍性疾病。(5)临床怀疑染色体病：例如有多发小畸形、先天性心脏病及智力障碍等，可以先进行高分辨率染色体核型分析，阴性者再进行aCGH检测。经济条件允许的话，临床表现不能直接判断出具体染色体病(如21三体等)的患儿。也可以直接进行aCGH检测。
2.正确解读遗传学检测结果：(1)判断遗传变异是否是致病性的：对于已报道的致病性突变，而且临床表型及遗传方式也符合的，可以确诊。对于未报道的新突变，需要根据满足以下条件才能推测为疾病相关的致病性突变：①突变对蛋白结构和功能可能有明显影响：例如移码、无义和剪接位点突变；②位于高度保守区、导致的氨基酸变异大的错义突变；③非已知的单核苷酸多态性(SNPs)：查询SNPs数据库，或者在大规模正常对照中检测此变异；④疾病易感性分离：符合遗传方式特点，例如常染色体显性遗传病的新生突变(de novo)，或者常染色体隐性遗传病，患者的两个等位基因上均发现了致病突变，或者X连锁隐性遗传病，男孩发病(病情重)，突变为新发或者来自母亲。(2)正确进行遗传咨询：遗传病的遗传咨询是专门的学科，需要专业化的培训和考核，因此一旦诊断遗传性疾病，最好建议去专门的遗传咨询门诊进行咨询。由于目前国内严重缺乏具有专业训练和资质的遗传咨询人才，因此临床医生也应该自觉地学习必要的遗传知识，能够帮助患者进行简单的遗传咨询。
3.正确评价遗传学检测的临床价值：虽然遗传性检测在儿科神经系统疾病的诊治中发挥着越来越大的作用，但是也应该清醒地看到其局限性。首先，临床基本功还是至关重要的，比如只有根据病程演变等临床特点进行准确的神经系统的定性诊断，考虑到遗传性疾病，才应该做相应的遗传学检测；再比如，如果不能准确地进行查体，明确症状和体征，把共济失调误认为肌无力(肌病)，那么就不可能选择正确的疾病靶向测序包，因为肌病和共济失调是两个不同的疾病靶向测序包。其次，还要了解所有使用的测序包是否适合自己的检测目的，目前商用的疾病靶向测序包各家公司所包含的基因可能不一样。第三，应该向患儿家长明确说明遗传学检测对于临床诊治的作用。遗传学检测对于绝大多数的遗传病，尤其是遗传变性病，能够明确诊断、判断预后、避免创伤性检查(如肌活检等)，但是大多数不能进行特异性治疗。因此，不能滥用遗传学检测，应该和家长充分沟通后，由家长决定是否愿意进行检测。当然，也有一些少数遗传病，明确诊断对于治疗具有关键的意义，比如我们医院的1例临床表型类似Dravet综合征的患儿，各种抗癫痫药治疗无效，由于SCN1A基因突变检测阴性，进一步做了癫痫靶向测序基因包，结果证实为维生素B6依赖症，应用维生素B6后癫痫完全控制。其他，如葡萄糖转运子l缺乏症等明确诊断后使用生酮饮食能够获得很好的疗效。
总之，随着遗传学检测技术的飞速发展，检测成本进一步下降，检测准确度逐渐提高，我们有理由相信在不久的未来，遗传学检测将日益成为一种临床常规的有效的技术手段应用于儿科神经系统疾病的诊疗工作当中。不仅能够帮助确定诊断，对患者及其家属进行遗传咨询、产前诊断，也能为患者的预后评估、特异性治疗提供重要依据，同时能够促进发病机制的深入研究及更有针对性的个体化治疗，从而改善患儿的预后。临床儿科神经医生，甚至所有临床儿科医生，都应该不断学习，更新自己的临床遗传学知识，积极掌握应用这些新的技术手段，更好的帮助广大患儿。
中华儿科杂志 2014年11月第52卷第11期
作者：姜玉武 谢涵（北京大学第一医院儿科）